O jogador está na pele de Leon, o mesmo protagonista de Resident Evil 2, que agora é um renomado agente da CIA e vai a um bizarro vilarejo situado na Espanha a fim de resgatar a filha do presidente dos Estados Unidos. No entanto, ao chegar lá, ele se depara com criaturas nada amigáveis, os chamados Ganados, homens infectados por um vírus que os torna bastante semelhantes a zumbis, mas com capacidade de correr e usar armas, por exemplo.

Devido às suas habilidades, os novos inimigos exigem maior dinamismo do jogador, coisa que os comandos novos permitem bem. Em RE4 há um novo sistema de mira, que fazem com que o jogador tenha maior controle e precisão ao atirar. A câmera agora tem uma nova perspectiva, situando-se sempre sobre o ombro do protagonista.